Амплификация

Амплификаторы (термоциклеры) для проведения полимеразной цепной реакции вы легко сможете выбрать и купить в интернет-магазине СТАЙЛАБ.

В молекулярной биологии под амплификацией понимают образование дополнительных копий какого-либо гена или его фрагмента. В основе ПЦР лежит процесс селективной амплификации, то есть копирования определенных нуклеотидных последовательностей. Для изоляции нужных фрагментов используются праймеры — искусственно созданные олигонуклеотиды, комплементарные тем участкам ДНК, которые ограничивают последовательность-мишень. Кроме того, праймеры служат необходимым компонентом для работы ДНК-полимеразы. Этот фермент, катализирующий полимеризацию ДНК, неспособен начинать синтез с нуля и нуждается в наличии небольшой цепочки нуклеотидов со свободной гидроксильной группой на 3’-конце, к которой и добавляются последующие элементы.

В настоящее время для проведения ПЦР используются термостабильные ДНК-полимеразы, выделенные из различных видов термофильных бактерий. Температурный оптимум таких ферментов составляет около 70–80° C, благодаря чему они не теряют своих свойств при нагревании до температуры плавления ДНК. Таким образом, с открытием термостабильных полимераз стало возможным проводить множественные циклы ПЦР без добавления свежих порций фермента.

В роли термостабильной ДНК-полимеразы чаще всего выступает Taq-полимераза, обнаруженная у бактерий Thermus aquaticus, однако применяются и другие ферменты, принадлежащие представителям родов Thermus и Pyrococcus. Для последнего характерны полимеразы, имеющие более высокую точность синтеза по сравнению со стандартной Taq-полимеразой. Это объясняется наличием у них 3’-5’-экзонуклеазной активности, которая позволяет корректировать вновь созданную последовательность нуклеотидов.

Помимо ДНК-полимеразы, праймеров и набора свободных нуклеозидтрифосфатов, обязательными компонентами ПЦР служат буферный раствор, обеспечивающий оптимальные условия реакции, а также собственно анализируемый образец. Реакция проводится многократно (циклично), причем матрицей для каждого следующего цикла служит не только исходная молекула, но и продукты предыдущих циклов, так что наращивание количества ДНК происходит экспоненциально. Каждый цикл ПЦР состоит из трех последовательных стадий, требующих различной температуры.

1. Денатурация (плавление) ДНК. На этой стадии реакционную смесь нагревают до 93–95° C, вследствие чего комплементарные цепи двухцепочечной ДНК расходятся.
2. Отжиг праймеров. Данный этап сопровождается понижением температуры до 50–65° C, при котором происходит гибридизация праймеров с одноцепочечной ДНК-мишенью.
3. Элонгация (удлинение) цепи ДНК. В ходе этой стадии температура составляет 70–80° C — оптимальная величина для работы термостабильной полимеразы, которая на матрице последовательности-мишени достраивает вторую цепь, начиная с 3’-конца праймера.

Строгая смена температурных режимов в ходе ПЦР достигается за счет использования специальных приборов — амплификаторов, или термоциклеров. Благодаря таким устройствам нагрев или охлаждение до нужной температуры происходит с точностью до десятых долей градуса и практически мгновенно. В интернет-магазине СТАЙЛАБ представлены варианты амплификаторов для ПЦР как с поддержанием однородных условий во всем реакционном блоке, так и с функцией градиентного нагрева. С ее помощью можно устанавливать разную температуру в отдельных точках блока, что позволяет быстро подбирать оптимальную температуру отжига для каждого случая.